人脐带间充质干细胞无血清培养基主要成分：氨基酸，维生素、无机盐、白蛋白，转铁蛋白、胰岛素、 微量元素，细胞因子等。
1. 人脐带间充质干细胞原代分离（贴壁法）
脐带简介：脐带包括脐带血、华通氏胶、两根动脉、一根静脉，所有这些结构被脐带上皮（内衬膜） 包裹。脐带是间充质干细胞的主要来源，其中华通氏胶只含有间充质干细胞一种干细胞，是最常用来分离培养间充质干细胞的结构。而内衬膜则含有至少两种干细胞：间充质干细胞和上皮干细胞，这两种干细胞也是细胞治疗的主要来源。
以下方法为从华通氏胶中分离高纯度的间充质干细胞详细步骤：
1.1. 无菌收集长度约 10cm 的脐带，迅速将脐带放到含有人脐带脂肪保存液（AC-1001016）的 50mL 离心管中。在 4℃条件下快速运到实验室，在 4h 内处理完成全部过程。
1.2. 将脐带置于生物安全柜中冰盒里放置的直径 10cm 培养皿中。用预冷的PBS 多次清洗脐带，去除残留的血液即止。以下分离组织块的过程确保全程脐带浸泡在预冷PBS 中保持湿润。
1.3. 使用剪刀径向剖开脐带，将血管以及周围的华通氏胶暴露出来。
用解剖刀将华通氏胶与血管分离，用镊子夹住血管，整条剥离，中间白色部分即华通氏胶（具体人 类脐带结构参见图 1） 。
1.1. 用剪刀将华通氏胶剪成 0.5-1cm 见方的薄片组织块，尽量不要太厚。最后剩余的脐带上皮（内衬膜）组织 弃除。
1.2. 每个直径 10cm 的培养皿中放置 10-15 个组织块，加入 6mL 完全培养基。置于 37℃，5%CO2 培养箱中培养 不同原代分离体系初始组织块数量以及细胞爬出率见表 1。
②为促进组织块贴壁，72 小时内不能摇晃培养皿，72 小时第一次换液也是同理。
培养们直径 | 初始组织块数量 | 细胞爬出组织块数量 | 细胞爬出率 |
10cm | 16.9 | 11.8 | 69.8% |
表 1 脐带组织块粘壁数据（平均数据）
1.1. 每 72 小时换液。一般 5-7 天可以看见贴壁组织块附近有细胞爬出，12-15 天细胞汇合度达到 70% 以上，即可准备传代。
1.2. 细胞传代时，用枪头吸掉组织块以及原有培养基，加入 5mlPBS 清洗一次。每个直径 10ml，的培养皿中加入 5ml 的细胞消化液（AC-1001024 ），摇匀覆盖皿底，37℃恒温箱 2-3min 或室温3-5min 孵育。
1.3. 显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离皿底，轻轻敲打皿底，细胞呈细沙状脱落，加入同体积完 全培养基，用移液枪扇形吹打使细胞完全脱落下来，将细胞悬液收集到 15mL 离心管中，300×g 离心 5min。
1.4. 用完全培养基重悬、计数，此时的细胞称为P0 代。相关代次预期收获细胞量请参考表 2。
1.5. 根据本公司统计数据，10cm 长的脐带，约可以收获 1.24×107 个P0 代细胞，一根脐带长度大约 20cm，约可以收获 2.5×107 个P0 代细胞。
1.6. 根据本公司检测，按 1:8 传代，细胞形态在P10 代内不发生变化。P10 代以上细胞没有实际应用意义，暂不检测。
脐带两端的组织原代分离效率有较大差异，近胎盘端分离效率要高于近胎儿端 10-30%。
P0 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | |
细胞数量 | 1.2×107 | 9.6×107 | 7.7×108 | 6.2×109 | 5.0×1010 | 4.0×1011 |
表 2 10cm 长的脐带P0-P5 代预计收获细胞数量（1:8 传代）
1. 人脐带间充质干细胞传代培养
1.1. 在显微镜下观察细胞，细胞汇合度达到 90%，即可准备传代;
1.2. 吸掉培养瓶/皿中的培养基，用 PBS 清洗一次，加入适量的细胞消化液（AC-1001024）覆盖瓶/ 皿底，37℃恒温箱 2-3min 或室温 3-5min 孵育。
1.1. 显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离瓶/皿底，轻轻敲打瓶/皿底，细胞呈细沙状脱落，加入等 倍体积的完全培养基，用移液枪扇形吹打使细胞脱落下来，并轻轻吹打成单细胞，将细胞悬液收集 到适当的离心管中，室温 300×g 离心 5min。
1.2. 弃上清，加入适量完全培养基，重悬细胞，按照比例进行传代或计数后按照 1.1-1.45×104 个/cm2 密度进行接种。均匀铺在培养皿/瓶中，置于 37℃，5%CO2 条件下培养。相关数据请见表 3。
注意：细胞规模生产建议 1:5-1:8 传代，一般 72 小时可以达到 90%以上汇合度。
清洗PBS 体积 | 消化液体积 | 培养基体积 | 接种细胞数量 | |
10cm dish | 5ml | 5ml | 10ml | 6.0-8.0×105 |
T25 培养瓶 | 3ml | 3ml | 5ml | 2.7-3.7×105 |
T75 培养瓶 | 8ml | 8ml | 15ml | 0.8-1.1×106 |
T175 培养瓶 | 18ml | 18ml | 35ml | 2.0-3.0×106 |
表 3 不同体系建议细胞接种数量及加液量
1. 人脐带间充质干细胞冻存
3.1. 同步骤 2.1；
3.2. 同步骤 2.2；
3.3. 同步骤 2.3；
3.4. 弃上清，用 4℃保存的无血清细胞冻存液（治疗级）（AC-1001006）重悬细胞，取部分细胞计数。
3.5. 计数后用无血清细胞冻存液（治疗级）（AC-1001006）调节细胞密度至建议冻存密度 1-5×106 个/mL，每支冻存管（需提前做好标记）分装 1.5-2mL，直接放入-80℃冰箱快速冻存。
3.6. -80℃放置过夜后转移至液氮长期保存。
2. 人脐带间充质干细胞复苏
2.1. 从液氮中取出冻存的hUMSC，37℃水浴快速融解。
2.2. 在生物安全柜或超净台中，先在 15mL 离心管中加入 5 mL 37℃预热的完全培养基，将解冻后的细胞悬液缓慢滴加到离心管中。
2.3. 300×g 离心 3min，吸掉上清，加入适量完全培养基重悬细胞至建议接种浓度（参考表 3）。
2.4. 将细胞悬液均匀滴加到培养瓶/皿中，水平十字振动培养瓶/皿使细胞均匀。置于 37℃，5% CO2 条件下培养 24 小时后观察细胞复苏状态。
2.5. 细胞无异常即可同时更换新鲜的完全培养基继续培养。
2.6. 初次换液后每 48-72 小时更换培养液直至传代。
