产品及特点
鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffi)具有反硝化能力。具体用于分类、研究，具有处理养殖废水潜力。同时，鲁氏不动杆菌的临床分布及耐药性也在进一步研究中，研究将用以指导临床合理用药，因此快速检测鲁氏不动杆菌具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测鲁氏不动杆菌的试剂盒，它具有下列特点：
1、即开即用，用户只需要提供DNA模板。
2、特异性高，引物是根据人鲁氏不动杆菌高度保守区设计,不会扩增其他细菌。
3、引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规PCR高100倍。
4、提供无传染性的PCR阳性对照，便于区分假阴性样品。
5、一管式操作，荧光PCR检测，不容易产生环境污染。
6、本产品只能用于科研，本试剂盒足够50次20μL体系的PCR。
规格及成分
成分 | 编号 | 十孔盒包装 |
2×qPCR MagicMix | 90408 | 0.5 mL(棕色) |
荧光PCR专用模板稀释液 | 180701 | 1 mL(亮黄盖) |
鲁氏不动杆菌PCR引物混合液 | 14-76700yw | 100μL(白盖) |
鲁氏不动杆菌PCR阳性对照(1×108拷贝/μL) | 14-76700pc | 50 μL(红盖) |
核酸释放剂试用装 | 61202 | 20次(1mL，绿盖) |
使用手册 | 14-76700sc | 1份 |
运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。
自备试剂
样品DNA。
使用方法
一、制备标准曲线样品(以102-107拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1、标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2、用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。
3、在7号管中加入5 μL阳性对照(其浓度为1×108拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×107拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4、换枪头，在6号管中加入5 μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
7、用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8、如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送20次免DNA提取的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为PCR模板，省略了DNA提取步骤。
三、设置qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
9、如果进行定量分析，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则6个标准曲线样品只选一个做(可以选4号，其余样品不变)。以下只介绍定量分析的反应设置。
10、在标记管中按下表加入各成分：
成分 | N+2个 样品管 | PCR阴性对照管 | 标准曲线 样品管(2-7管) |
2×qPCR MagicMix | 10μL | 10μL | 各10μL |
鲁氏不动杆菌PCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
自备10×ROX (见注) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
N+2个待测样品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
自备超纯水 | 不加 | 6 μL | 不加 |
第7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号) | 不加 | 不加 | 各6μL(2号样到2号管，3号样到3号管…) |
注:仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX，则用水替代。
11、盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
四、荧光定量PCR反应参数
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 94℃ | 5 min |
PCR反应(40个循环) | 94℃ | 0.5 min |
50℃ | 0.5 min(采集SYBR通道的荧光信号) | |
72℃ | 0.5 min | |
最后延伸 | 72℃ | 10 min |
五、数据处理
12、设定60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。
13、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
14、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
