产品及特点
莱氏无胆甾原体属于柔膜体纲，支原体目，无胆甾原体科，无胆甾原体属。
莱氏无胆甾原体最初分离自污水、肥料、腐土质、土壤和植物组织，后来人们发现在牛生殖道和鼻腔、猪鼻腔、人口腔、鸡窦等各种哺乳动物和鸟类中均发现其寄生现象。莱氏无胆甾原体也是常见的污染细胞的支原体之一。本公司开发了简单快捷的莱氏无胆甾原体探针法荧光定量 PCR检测试剂盒，它具有下列特点：
1、即开即用，用户只需要提供样品 DNA模板。
2、根据莱氏无胆甾原体保守区域设计引物和探针，能专一性地检测出样品中的莱氏无胆甾原体。
3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4、一管式闭管操作，降低了交叉污染。
5、快速，整个检测过程(按一个样品计)所需时间仅为 2.0小时。
6、本只能用于科研，足够 50次 20μL体系的荧光定量 PCR
规格及成分
| 成分 | 编号 | 十孔盒包装 |
| 2×Probe qPCR Magic Mix | 190303 | 500 μL(本色盖) |
| 荧光 PCR专用模板稀释液 | 180701 | 1 mL(黄盖) |
| 莱氏无胆甾原体探针法 qPCR引物混合液 | 15-75400yw | 100 μL(白盖) |
| 莱氏无胆甾原体 qPCR探针 | 15-75400pb | 50 μL(棕色管) |
| 莱氏无胆甾原体 qPCR阳性对照(1×108拷贝/μL) | 60908- 75400pc | 50 μL(黄盖) |
| 使用手册 | 15-75400sc | 1份 |
运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。
自备试剂
样品 DNA。
使用方法
一、稀释标准曲线样品(以 102-107拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)
1、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。
3、在 7号管中加入 5 μL 1×108拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×107拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA的制备
7、如果有 N个样品，**设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。
8、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
9、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
| 成分 | 样品管N+2个 | PCR阴性对照管 | 标准曲线样品管(2-7管) |
| 2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 莱氏无胆甾原体 qPCR探针 | 1 μL | 1 μL | 各 1 μL |
| 莱氏无胆甾原体探针法 qPCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| N+2个待测 DNA模板 | 7 μL | - | - |
| 超纯水 | - | 7 μL | - |
| 第 7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号) | - | - | 各 7 μL(2号样到2号管，3号样到3号管…) |
11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 5 min |
| PCR反应(40个循环) | 95℃ | 15sec |
| PCR反应(40个循环) | 60℃ | 1 min(采集 FAM通道的荧光信号) |
四、数据处理
12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log值，再推算出其浓度。
13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。若重复结果 Ct值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
